多肽合成:多肽序列要怎样去设计呢?

2022-01-04 17:19

  肽的序列、长度和氨基酸的组成影响肽的正确组装和纯化。这些因素也决定了多肽产品的溶解度。在设计多肽时,应考虑以下几点:


  1.多肽序列的设计。


  多肽的生物活性大多来源于天然蛋白质的N-端、C-端或中间部分。然而,由于各种原因,这些自然序列有时需要修改。即使是一些相对较短的序列,也有一些必要和不必要的氨基酸残留基础,但这些残留基础的重要性不容易确定。我们通常对这些不必要的氨基酸残留基础进行一些修改:氨基酸残留基础的替代(多肽的溶解性、稳定性等);化学修饰(稳定性、结构功能研究);连接配体抗原等。对于一些来自蛋白质中间的序列,有时必须用乙酰化和酰胺关闭N-端或C-端,以避免引入自然序列中不存在的电荷。对于结构较大的配体,通常需要在配体和多肽之间引入连接臂,以减少配体对多肽折叠的影响。


  2.多肽的长度。


  随着多肽长度的增加,粗多肽的长度通常会降低。对于长度小于15个氨基酸残基的多肽,收率通常令人满意,易于合成。


  3.溶解性


  多肽的氨基酸组成是多肽设计的一个非常重要的方面,这往往被忽视。氨基酸的组成极大地影响了多肽的溶解度。含有高比例疏水性残留物的多肽在水溶液中的溶解度非常有限甚至完全不溶,如亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。接下来,很难使用这些多肽进行实验,也很难纯化。我们建议疏水性氨基酸在多肽中的比例小于50%,每五个残留物中至少有一个带电荷的残留物。在生理pH值下,天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸都有带电的侧链。


  4.氨基酸困难。


  多肽含有多个半胱氨酸、蛋氨酸或色氨酸,很难获得高纯度,因为这些氨基酸的侧链容易被氧化或发生副作用。如果可能的话,多肽应该尽可能少地含有这些残留的基础。通常我们可以用亮氨酸代替蛋氨酸,用丝氨酸代替半胱氨酸。如果有许多来自天然蛋白质的多肽或Overlapping多肽需要合成,我们可以在每个多肽的起点做一些改变,使亲水性残留和疏水性残留达到更好的平衡。例如,在所选多肽的起点或终点有两个半胱氨酸,将两个半胱氨酸分离到两个多肽中,使合成和纯化更加容易。


  5.二级结构。


  Z在设计多肽时,我们应该考虑β折叠的形成。在合成过程中,随着多肽链的延长,β折叠结构导致产品中的许多缺失序列。选择不要含有更多的连续缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸序列。如果不能避免这些残留序列,我们可以在每三个残留物中插入一个甘氨酸或干氨酸,用天冬酰胺代替谷氨酰胺,或用丝氨酸代替苏氨酸。


  分析多肽序列:


  带正电荷的残基:赖氨酸、精氨酸、组氨酸、N-末端。


  带负电荷的残基:天冬氨酸、谷氨酸、C-末端。


  无电荷的疏水性残留物:苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸。


  无电荷残基:甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、乙酰化、酰胺化。


多肽合成


  1.N-末端。


  N-末端的谷氨酰胺在切割酸性条件下容易环化为焦谷氨酸。我们建议用焦谷氨酸代替N-末端的谷氨酰胺,去除谷氨酰胺,用其他氨基酸代替谷氨酰胺,或者用乙酰化修饰N-末端的谷氨酰胺。当冬酰胺位于N-末端时,会形成一个难以去除的保护基团。我们建议去除N-末端的冬酰胺或用其他氨基酸代替。


  2.C-末端。


  如果C-末端的非天然氨基酸包括D-氨基酸,则C-末端应酰胺化。如果需要在C-末端进行修改(荧光染料、生物素等),修改必须通过赖氨酸的侧链连接,这些肽的C-端也应酰胺化。


  3.序列


  随着多肽长度的增加,偶联反应的效率会越来越低,粗制品的纯度也会越来越低。然而,少于5个残留物的多肽也会导致切割和纯化过程中的问题。含有3-5个残留物的序列应至少含有一个疏水性残留物(亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸)或疏水性修饰物。


  a)序列中含有多种脯氨酸,容易形成顺式/反式异构体,导致纯度降低。


  连续丝氨酸序列导致片段缺失,纯度降低。


  c)序列中多种天冬氨酸容易形成天冬亚酰胺,导致纯度降低。


  d)序列中过多的修改通常会影响多肽的纯度和收率。


  e)连续多种甘氨酸(4个或更多),多肽骨架之间容易形成氢键,使多肽难以溶解和纯化。


  F)磷酸化修饰导致偶联效率降低。由于合成是从C-末端到N-末端,磷酸化修饰的氨基酸到N-末端之间应少于10个残基。


  4.溶解性


  通常每5个氨基酸残基中至少含有一个带电荷的残基(包括未关闭的C-末端和N-末端)。如果含有足够的电荷,保证连续不带电荷的残基数量不超过5个。